جهت مطالعه بخش اول مقاله نقش هورمون ها در تخمریزی و اسپرم زایی ماهیان بر روی لینک زیر کلیک نمایید:

استفاده از هورمون در تخمریزی و اسپرم زایی ماهیان (بخش اول)

هورمون تراپی برای القاء اوولاسیون و تخمریزی

 بیشترین بررسی در استفاده از هورمون برای القاء مراحل FOM ، اوولاسیون و  Spermiation در شرایط مصنوعی میباشد. در ماهیان آزاد اقیانوس آرام  (Oncorhynchus sp)مرگ و میر زیاد قبل از مرحله FOM و اوولاسیون رخ می­دهد. استفاده از هورمون می­تواند بلوغ و اوولاسیون را برای چند هفته کاهش دهد و در نتیجه مرگ و میر قبل از تخمریزی کاهش می ­یابد.

در محور مغز، هیپوتالاموس، هیپوفیز، گناد هورمونهای مختلفی دخیل هستند که هورمون تراپی منوط به استنباط صحیح از این محور و هورمونهای مترشحه از آن میباشد.

نقص هورمونی در ماهیان پرورشی

 نقص در شکل گیری FOM ، اوولاسیون و تخمریزی عمدتا از این منشا میگیرد که ماهیان در شرایط مصنوعی نمی توانند شرایط طبیعی زیست محیطی خود را تجربه کنند (مثل دما، عمق و وجود مواد شیمیایی) برای غلبه بر این مشکل باید نقص هورمونی ناشی از نبود این شرایط طبیعی را پیدا نمود که نهایتا منجر به FOM، اوولاسیون و تخمریزی یا اسپرم گیری میشود.

ماهیان مولدی که نقص اوولاسیون را دارند هورمونهایی که FOM  و اوولاسیون را القاء میکنند) یعنی (LH بعد از تولید در هیپوفیز ذخیره شده و به خون ترشح نمی شوند. در نتیجه LH نمی تواند به گناد برسد و پدیده  FOMرا القاء نماید. در مولدین ماده شانک سرطلایی (Sparus aurata) میزان LH هیپوفیز با نزدیک شدن به فصل تخمریزی افزایش می یابد ولی بعلت ترشح نشدن به خون عمل   FOM و اوولاسیون رخ نمی دهد.

بررسیها در ماهی Striped Bass نشان می دهد که ماهیان صید شده از طبیعت سطح بالایی از  LH پلاسما را دارند ولی میزان آن در خون ماهیان پرورشی پائین است. بررسیها نشان میدهد که نقص اکثر ماهیان پرورشی که در معرض FOM ، اوولاسیون و تخمریزی قرار نمیگیرند ناشی از کمبود   LHمترشحه به جریان خون است

استفاده از فرآورده های گنادوتروپین GTH 

قبل از شکل گیری تکنیک های اندازه گیری هورمون و تعیین نقص آن، دستکاری درون ریز برای القاء ماهیان پرورشی برای FOM و اوولاسیون صورت گرفته است.

۱- عصاره هیپوفیز ماهیان

استفاده از هیپوفیز و عصاره آن برای القاء تخمریزی در ماهیان در دهه ۱۹۳۰ در برزیل آغاز شد و سپس در آمریکا و ژاپن دنبال گردید. هیپوفیز مولدین بالغ نر و ماده  آماده  تکثیر استخراج شده و بعلت تجمع GTH در هیپوفیز اثر بیشتری در القاء تخمریزی دارند. در اکثر موارد ۲۰-۱۰ درصد از هیپوفیز کل به ماهی تزریق میشود و مقدار بیشتر آن ۲۴-۱۲ بعد به ماهیان تزریق میشود. موثرترین دوز از  ۱۰- ۲ میلی گرم هیپوفیز در کیلوگرم وزن بدن استفاده میشود.

مشکلات استفاده از هیپوفیز

۱- متغیر بودن محتویات  LH هیپوفیز

۲- وجود ناخالصی در عصاره هیپوفیز که میتواند در فیزیولوژی ماهیان اثر منفی داشته باشد.

۳- انتقال بیماری

 میزان LH هیپوفیز بر اساس  وزن بدن، جنس و سن ماهی، زمانی از سال که ماهی برای استخراج هیپوفیز انتخاب میشود و زمانی که از مرگ ماهی تا جمع آوری و حفاظت از هیپوفیز سپری میگردد متغیر است.

برای برطرف کردن  مشکلات عصاره هیپوفیز میتوان از طریق خالص سازی یا آماده سازی بهتر  LH اقدام شود.امروزه فراورده های  خالص شده گنادوتروپین ماهی آزاد و کپور بصورت تجاری وجود دارد ولی بهتر است از گنادوتروپین خاص هر گونه با قرابت ژنتیکی  استفاده کرد تا مفیدتر واقع شود.

مزایای استفاده از عصاره هیپوفیز

۱- دسترسی آسان

۲- نگهداری آسان

۳- ارزان قیمت بودن

بعنوان مثال زمانیکه از عصاره هیپوفیز کپور سرگنده و نقره ای برای القاء تخمریزی در کپورماهیان آسیایی استفاده میشود هزینه آن چند برابر کمتر از LH خالص شده ماهی آزاد است.

تکنیک هیپوفیزاسیون هرچند  ابتدایی ترین روش القاء هورمونی در ماهیان است ولی امروزه بویژه در کشورهای در حال توسعه یا مناطق دور افتاده که نمیتوانند از هورمونهای خالص شده گران قیمت استفاده کنند همچنان استفاده میگردد.

گنادوتروپین جفت انسانی   HCG  (Human chorionic gonadotropin)

استفاده از این هورمون در اوایل دهه ۱۹۷۰ آغاز شد که از ادرار زنان باردار تهیه میشد. میزان دوز مصرفی آن بین  IU / kg4000- 100 وزن بدن است و تاثیر بالای آن احتمالا بعلت زمان ماندگاری بالای آن در خون است.

در ماهی سوکلا (Rachycentron  canadum) یک دوز نسبتا پائین HCG( IU / kg 275) برای القاء اوولاسیون کافیست. در بس استرالیایی (Macquaria novemaculata) ، HCG با دوز IU / kg  ۵۰۰ برای القاء اوولاسیون  صورت میگیرد. در ماهی سرخو (Lutjanus argentina) تزریق IU / kg 1500 باعث تخمریزی میگردد.

ماهیان نر نسبت به ماهیان ماده به دوز کمتری ( ۲ تا ۴ برابر کمتر) برای القاء Spermiation نیازمند هستند. بالا بودن زمان ماندگاری HCG در خون و اثر طولانی مدت آن روی بلوغ گنادها باعث القاء Spermatogenesis و Spermiation در مارماهی ژاپنی (A. japonica) شده است.

مزایای استفاده از HCG

مستقیما در سطح گناد عمل می کند و نیازی به وجود LH یا فعال سازی گنادوتروپین نیست . حتی بعضی مواقع از  GnRHa نیز بهتر عمل میکند چون هنگام تزریق با GnRHa یک دوره طولانی نیاز است که میتواند منجر به مرگ و میر ماهیان شود.

معایب استفاده از HCG

در بدن ماهیان یک سیستم ایمنی علیه این هورمون شکل میگیرد که اگر با دوز سالهای قبل به بدن تزریق شود موثر نخواهد بود. در نتیجه دوز نسبتا بالایی را برای سالهای بعد باید استفاده نمود.

GnRH و GnRHa  

در اوایل دهه ۱۹۷۰ در هیپوتالاموس  پستانداران هورمونی شناسایی شد که باعث رهاسازی LH میشد و به GnRH یا LH-RH معروف گردید. سپس نوع سنتتیک آن بنام GnRHa تولید گردید که حتی نسبت به GnRH موثرتر بود ( GnRH و  اشکال سنتتیک آن دکاپپتیدهای کوچک هستند) . ‍‌‌‌تاثیر  GnRH و GnRHa این فرضیه را ثابت نمود که در ماهیان با اختلالات تولیدمثلی ، هیپوفیز هنوز قادر است رهاسازی GTH را انجام دهد.

مزایای استفاده از GnRH و GnRHa

۱- سیستم ایمنی بدن ماهیان را تحریک نمی کنند.

۲- از طریق القاء رهاسازی LH اختلالات هورمونی درون ریز که باعث نقص در مراحل FOM،  اوولاسیون و تخمریزی  میشود را اصلاح مینماید.

۳- چون در سطح هیپوفیز عمل میکند در نتیجه تحریک منظم تری  از وقایع تکثیر را انجام میدهدو سازگاری بهتری را با عملکردهای فیزیولوژیک  که مستقیم یا غیرمستقیم در رهاسازی هورمونهای دیگر که در FOM، اوولاسیون ، تخمریزی  یا  Sermiation میتوانند نقش داشته باشند را ایفا مینماید ( مانند پرولاکتین، هورمون رشد و هورمونهای تیروئیدی)

۴- این هورمون  میتواند به شکل خالص تولید شده و انتقال بیماری را کاهش دهد.

۵- در اکثر ماهیان تشابه ساختاری داشته و در اکثر ماهیان قابل استفاده است.

تفاوت GnRH و GnRHa

 GnRH نیمه عمر پائینی داشته و خیلی سریع توسط آنزیمهای آندوپپتیداز موجود در  هیپوفیز، کبد و کلیه تجزیه میشود که پیوندهای ۶-۵  و ۱۰-۹ را میشکنند. اما در GnRHa در موقعیت ۶ اسید امینه و در موقعیت ۱۰ یک گروه  اتیل آمید قرار میدهند که در مقابل تجزیه آنزیمی پایدار است. در نتیجه نیمه عمر بالایی داشته و  میتواند ترشح GtH را برای مدت زمان زیادی تحریک نماید.

 این مزایا باعث میشود که GnRHa 100- 30 برابر قویتر از GnRH عمل کند و  میزان ترشح و ماندگاری LH  را نسبت به GnRH افزایش دهد.

هنگام استفاده از GnRHa بایستی از هورمونهای آنتی دوپامین نظیر دومپریدون، پیموزاید، رسرپین یا متوکلوپرامید استفاده نمود. این هورمونها فقط در یک دوز و همراه با اولین تزریق GnRHa  به بدن تزریق میشوند که اثر ممانعت کنندگی دوپامین در ترشح GTH از بین میرود و با تزریق دوم GnRHa رهاسازی GTH بهتر انجام میشود.

میزان بازدارندگی دوپامین در طول چرخه تکثیر و تولید مثل تغییر میکند مثلا در گلدفیش در طول فصل تکثیر بالاست و در ماهیان دیگر حداقل میباشد.

اثر بازدارندگی دوپامین در کپورماهیان و گربه ماهیان وجود دارد ولی در اکثر ماهیان دریایی مهم و پرورشی دیده نمیشود و این میتواند یک مزیت در تکثیر آنها باشد

سیستم رهاسازی مداوم GnRHa

 Implant hormon

از آنجائیکه  GnRHaدر مقابل تجزیه آنزیمی مقاوم است و باعث تحریک طولانی مدت در رهاسازی GTH میشود اما در محیط In vivo فقط ۲۳ دقیقه ماندگاری دارد ‌] GnRH  برای ۵ دقیقه[  

این زمان در اکثر گونه ها برای FOM، اوولاسیون و تخمریزی بسیار کم است و استفاده از یکبار تزریق نیز ناکافی میباشد. بعنوان مثال برای القاء تخمریزی در ماهی سوف زرد (Perca flavescens) و اکثر آزاد ماهیان ۲ بار تزریق نیاز است. البته در دمای پائین و یا در مراحل اولیه توسعه گنادی حتی ۲ بار تزریق نیز کافی نمیباشد. در ماهی Striped Bass  که ویتلوژنزیز را پشت سر گذاشته اند با ۲ بار تزریق بندرت در معرض FOM قرار میگیرند.

با حذف GnRHa از خون ، LH  پلاسما بطور چشمگیری کاهش یافته و میزان E2 و تستسترون نیز به سطح اولیه خود برمیگردند. این بررسی ها مشخص می کند که سیستم رهاسازی طولانی مدت GnRHa میتواند ابزاری مهم در کنترل بلوغ  این گونه باشد.                                              

     انواع سیستمهای رهاسازی  GnRHa  (کاشت هورمون)

۱- GnRHa  

با کلسترول و سلولز ترکیب شده و بصورت پلتهای جامد و استوانه ای شکل به قطر mm3 تهیه شده و با کمک اسکالپل یا هر وسیله سوزنی شکل در عضله کاشته میشود.

این نوع سیستم دارای ۲ شکل است :

۱-۱- نوع کند که در عرض چند هفته ترشح GnRHa را کنترل میکند و برای حداقل ۸ هفته میزان GTH خون بالا میماند.

۲-۱- نوع تند که در عرض چند روز ترشح GnRHa را کنترل میکند و برای حداقل ۸ روز میزان GTH خون بالا میماند.

این ترکیبات به آسانی قابل ساخت بوده و ارزان قیمت هستند ولی نحوه رهاسازی GnRHa از آنها متغیر است که میتواند به ترکیبات آنها بستگی داشته باشد ( متغیر بودن کلسترول و سلولز کند یا تند بودن این سیستم را تعیین میکند).

۲-   Microspheres LGA  

ذرات ریز کروی به قطر ۲۰۰- ۵ میکرون هستند که از پلیمرهای اسید لاکتیک و اسید گلیکولیک (LGA) تولید میشود. این ترکیبات در ابتدا برای بخیه زدن در جراحی استفاده میشدند ولی بعد بعنوان یک سیستم رهاسازی مورد استفاده قرار گرفت.

GnRHa در قطرات آب میکروسکوپیک حل شده و در ماده LGA محبوس میشود و همراه با یک ماده لزج  چسبناک در عضلات بدن کاشته میشود. رهاسازی هورمون از این ذرات کروی در عرض چند ماه اتفاق می افتد که بستگی به نسبت اسید لاکتیک به گلیکولیک و وزن مولکولی پلیمر دارد.

امروزه LGA مختص ماهیان ساخته شده و در ماهیانی مثل شانک سرطلایی، ماهیان آزاد اقیانوس آرام و اطلس و دیگر ماهیان پرورشی استفاده شده است.

۳- Microsphere Fa – Sa                      Fatty Asid– Sebasic Asid      

این ذرات کروی از پلیمرهای مشترک بویژه پلیمر مشترک اسید چرب و اسید سباسیک ساخته میشوند. مزیت بزرگ استفاده از ذرات کروی این است که قابلیت تجزیه زیستی (Biodegradable) را دارا هستند و بعد از تجزیه فراورده هایی مثل اسید لاکتیک، اسید گلیکولیک و اسید سباسیک تولید میشوند که برای مولدین که قدرت تولید مواد مغذی آنها کم است میتواند بعنوان غذا مطرح باشد.

 ۴- پلیمر EVAc

این ترکیبات بصورت جامد، کروی و پهن به قطر mm 2 ساخته میشوند  که از پلیمر مشترک اتیلن و استات وینیل (EVAc) است که غیر قابل تجزیه میباشد. GnRHa  توسط EVAc محبوس میشود. ترکیب EVAc مانند پلتهای کلسترول غیر قابل تجزیه بوده و از نیمه عمر بالایی برخوردارند و اگر در دمای -۲۰c°  نگهداری شوند تا ۳ سال قابل استفاده است.

سیستم رهاسازی  GnRHa  کارایی زیادی در القاء تخمریزی در ماهیان که رشد تخمدان آنها بصورت غیرهمزمان (Asynchronous) و یا بصورت تخمریزی چند مرحله ای (Multiple – Batch group – Synchronous) هستند را نشان میدهد.

در این ماهیان اگر فقط یکبار تزریق GnRHa صورت گیرد با فرض بر اینکه ماهیان در مرحله پیشرفته رشد تخمدانی باشند فقط FOM و تخمریزی القاء میشود و به محض حذف شدن GnRHa از خون ماهیان تخمریزی متوقف میشود. مثل بس اروپایی، شانک سرطلایی، شانک قرمز مدیترانه ای         (Pagrus pagrus) ، کفشک دم زرد (Pleuronectes Ferrugineus)، فلاندرتابستانی       Paralichthys dentatus) (و کفشک دریای شمال (Pleuronectes platessa).

در ماهیان نر استفاده از سیستم رهاسازی GnRHa باعث افزایش تولید اسپرم میشود. بعنوان مثال در کارگاه هایی که Striped Bass  هیبرید تولید میکنند از ماهیان نر White Bass و ماده های Striped Bass استفاده میشود. ماهیان نر بعلت کوچک بودن اسپرم کمی تولید میکنند و بعد از ۳-۲ روز دیگر قابل استفاده نمی باشند.

زمانیکه از HCG  استفاده میشود دوباره تولید اسپرم آغاز میشود ولی میزان اسپرماتوزوآ آن پائین بوده و عمدتا حاوی مایع اسپرمی است. اما وقتیکه از سیستم رهاسازی GnRHa استفاده میشود اسپرم با تحرک و غلظت مناسب تولید میشود. در Rabbiit Fish  (Siganus guttatus) وقتیکه با یکبار تزریق GnRHa تیمار میشوند تنها برای چند روز افزایش در تولید اسپرم دیده میشود.

توانایی سیستم رها سازی GnRHa برای القاء اسپرمیشن ابتدا در آزادماهیان بررسی گردید و استفاده از پلتهای کلسترول، ترکیبات EVAc، LGA و Fad – Sa باعث آغاز اسپرمیشن و افزایش مقدار اسپرم قابل استحصال از ماهی آزاد(S.salar)، قزل الای قهوه ای(S.trutta)، ماهی آزاد چینوک(O.tshawystcha) شده است. در بس اروپائی استفاده از این سیستم افزایش منی را برای مدت ۳۵ – ۲۸ روز  و تزریق یکبار آن برای ۷ روز این پدیده را باعث میشود.

سیستم رهاسازی مداوم GTH Sustained – release delivery system for GTH      

اگر چه استفاده از سیستم رهاسازی مداوم در القاء FOM، اوولاسیون و تخمریزی در ماده ها و افزایش اسپرم در نرها خیلی موثر است ولی در مورد مولدینی که در مراحل نهایی توسعه گنادی قرار ندارند چندان موفقیت آمیز نبوده است. مثلا شگ ماهی اقیانوس آرام (Clupea harengus pallasi) در ماه سپتامبر که گنادها در مراحل ویتلوژنزیز و اسپرماتوژنزیز هستند زمانیکه از هورمون استفاده میشود اثری از رشد گنادی دیده نمیشود ولی در ماه فوریه که گنادها در مراحل نهایی توسعه گنادی قرار دارند مراحل FOM و Spermiation مشاهده میشود.

همچنین در ماهی فلاندر Paralichthys dentatus  و  Paralichthys lethostigma پلتهای کلسترول GnRHa در القاء FOM در ماده هایی که در مراحل اولیه یا میانی ویتلوژنزیز هستند بی تاثیر است. در حالیکه تزریق روزانه عصاره هیپوفیز کپور (CPE) رشد تخمک و FOM  را باعث میشود.

انواع سیستم رهاسازی GTH

۱- امولسیون ژلاتین لیپوفیز شده LG حاوی انهیدراتهای لیپیدی مختلف

امولسیون LG با LH خالص شده سالمون (sLH) ترکیب شده و مورد استفاده قرار میگیرد. در مارماهی ژاپنی باعث افزلیش مداوم در LH پلاسما برای ۲۴ روز بعد از تیمار میشود و بعد از ۹ هفته به شاخص گنادوسوماتیک بالا میرسند و سپس با استفاده از ترکیب sLH و ۱۷,۲۰B-P با موفقیت عمل اوولاسیون انجام میشود.

۲- پلیمر حاوی HCG

نوعی پلیمر قابل تجزیه است که با HCG ترکیب و بصورت یک ماده خمیری شکل و چسبناک به بدن تزریق میشود. در ماهی  Striped Bass در شرایط In vitro  بررسیها نشان میدهد که رهاسازی HCG در روز ۵ بالا بوده و در روز ۱۳ بطور چشمگیری افزایش می یابد. در شرایط In vivo که بعد از ویتلوژنزیز آزمایش شده است میزان HCG پلاسما ۳ روز بعد از تیمار بالا بود و بعد از ۲۵ روز همچنان در خون وجود داشت و در ۱۰۰ درصد ماده ها بعد از ۵ روز از زمان تزریق FOM و  اوولاسیون اتفاق افتاد.

کاشت هورمون در مولدین وحشی ماده تاس ماهی ایرانی  که در مرحله ۴ رسیدگی جنسی بودند انجام شد. پلت های کلسترولی حاوی LHRHa  در غلظت ۰، ۱۰، ۱۵ و ۲۰ ug/kg در این بررسی مورد استفاده قرار گرفتند. سپس نرخ لقاح، نرخ هچ و میانگین تعداد لاروهای بدست آمده در تیمار شاهد و تیمارهای دیگر مورد بررسی قرار گرفتند. در همه تیمارها جز تیمار شاهد بلوغ نهایی اووسیت به طور کامل و با موفقیت انجام شد. این هورمون باعث تحریک موفق  توسعه گنادی مولدین و آماده سازی آنها جهت اوولاسیون میشود.

نتایج نشان داد اختلاف معنی داری بین تیمارها از نظر موارد فوق وجود داشت. بطوریکه نرخ لقاح، نرخ هچ و میانگین تعداد لاروها در تیمارهایی که دوز ایمپلنت آنها بیشتر بود به طور معنی داری بیش از سایر تیمارها بود. این بررسی نشان داد با افزایش دوز هورمون در مولد این شاخص ها افزایش میابند که نشان دهنده تاثیر مثبت کاشت هورمون در این مولدین میباشد.

در این روش به دلیل اینکه یک بار فقط ماهی دستکاری میشود استرس کمتری به مولد وارد میشود و ماهی هورمون را طی مدت طولانی تری دریافت میکند که این امر اثر مثبت و معنی داری در فرآیند لقاح دارد. در بررسی های دیگر افزایش کیفیت تخم و بقای لاروها در روش کاشت هورمون نسبت به روش تزریق مشاهده شده بود.

گرچه کاشت هورمون مزایای خاص خودش را دارد ولی هنوز به شکل  تجاری در سایزها و دوزهای مختلف برای ماهیان مختلف پرورشی وجود  ندارد و باید از روشهای ذکر شده در منابع برای ساخت دوز مورد نیاز استفاده کرد بنابراین از  تزریق هورمون  برای فرآیند لقاح بیشتر استفاده  میشود و نیاز به مطالعات بیشتری در زمینه کاشت هورمون میباشد.

جهت کسب اطلاعات بیشتر در زمینه نقش هورمون ها در تخمریزی و اسپرم زایی ماهیان بر روی لینک زیر کلیک نمایید:

استفاده از هورمون در تخمریزی و اسپرم زایی ماهیان (بخش اول)